1多糖的提取、分离及纯化

1.1多糖的提取
多糖提取的原料一般采用传统中药或一些待研究植物的干品，将其粉碎过筛，烘干备用。多糖的种类繁多，且存在于植物的部位也不尽相同，因此，对于不同的目标物，其提取方法也不同。常用的提取方法有热水浸提、超声抽提以及其它提取剂的提取。如在锁阳多糖的研究中，所采用的提取方法即是先用95%乙醇脱脂，然后用沸水在挥尽乙醇的药渣中多次提取，合并提取液，离心取上清液，浓缩至小体积，蒸馏水返溶，加3倍量95%乙醇，离心，收集沉淀，有机溶剂洗涤后得到粗多糖。而在研究白岌粗多糖的提取时，则采用了五种不同的提取剂:蒸馏水、1.5%草酸、3%草酸,O.15moVL NaOH,O.3moVLNaOH来分别处理。除此之外，还可采用超声处理来提取多糖。
多糖提取的目的是为了使尽可能多的多糖成分从原材料中被分离出来，为进一步分离纯化打好基础。因此，此阶段要在保证产率的前提下，尽量简化操作步骤，最常用的方法是热水浸提法。

1.2多箱的纯化分离
在粗多糖的基础上，进一步去除杂质或者使棍合多糖逐一得到分离。常用的纯化法有醇沉法、柱纯化法等多种方法。如将粗褐藻糖胶溶于水，加乙醇至30%浓度，除去不溶物，然后继续加乙醇至70%浓度，并加少许NaCl，生成的沉淀经乙醇、乙醚洗，干燥即为纯的褐藻糖胶。也可以先用大孔吸附树脂4006柱纯化抽提液，而后再进行醇沉，从而得到纯的混合多糖。

由上述过程得到的多糖往往是混合物，为了对其组成特性有一个全面的了解，就需要对上述样品进行分离。最为常用的分离方法是柱色谱，早在40年代初，活性炭柱色谱法就用于分离糖类。50年代初，Whistler等做了改进，采用乙醇溶液的梯度洗脱，使单糖、二糖、三糖、四糖和五糖之间得到分离。如用DEAEsephadex A一25柱层析分离当归多糖，上柱后先用蒸馏水洗脱，再分别用醋酸缓冲液梯度洗脱，苯酚一硫酸法检测，按峰位收集，洗脱液透析后，减压浓缩和冷冻干燥得到多糖组分。也有关于用sephadex G一100和sephadex G一150凝胶色谱柱分离锁阳多糖的文献报道。除了柱色谱在混合多糖的分离中有广泛的应用，其它色谱法如纸色谱及薄层色谱法也都有应用。但这些经典的层析法分辩率低，分析时间长，定量测定困难。因而，实验设计以及生产工艺的设计多选择柱色谱作为分离的有效方法。

随着电泳技术的日趋完善，传统的电泳法及80年代后期迅速发展起来的高效毛细管电泳法也能进行糖的分离。如多糖的滤纸电泳、多糖的玻璃纤维纸电泳、多糖的醋酸纤维薄膜电泳以及多糖的凝胶电泳等。这些电泳法具有高效、快速、微量测定等各种优点，但是其操作复杂，对样品的适用性也比较差，很多因素都能对其结果产生影响，因而，只有在对样品有一定的了解后才能有很好的应用。

2多糖的定性及定盈分析
多糖的定性及定量方法有很多种，有色谱法、电泳法以及各种化学方法，但最为常用的则是色谱法。
在进行色谱分析以前，需要对样品首先进行水解，是色谱技术用来确定多糖、寡糖中各种单糖组分构成的前提。一般控制酸的浓度、温度、时间等可以达到多糖、寡糖的部分水解和完全水解。在具体的一个水解方法确定以前，要用多种水解方法比较水解结果，从而确定适当的水解方法。如在研究壳聚糖的水解方法时，即采用6种方法比较，最终选定最佳的水解条件是6 N HCl 100℃水解8h。在水解过后，可以进行色谱分析。

2.1气相色谱法
采用气相色谱法测定糖类，由于糖类本身没有挥发性，所以在气相色谱分析之前预先转化成易挥发、对热较稳定的衍生物。目前常用的衍生物有:糖的三甲基硅醚衍生物、糖肘三甲基硅醚衍生物、糖睛乙酸酪衍生物、糖醇乙酸醋衍生物和三氟乙酸醋衍生物等。

2.2高效液相色谱法
糖的高效液相色谱法分析在70年代就开始研究，多年来已取得了较大的进展，成为常量及微量单糖和寡糖重要的分析分离方法之一。到目前为止，有两种通常采用的方法:一是使用化学键合固定相，以乙睛一水或乙睛一甲醇一水作为流动相，单糖或寡糖由示差折射检测器检测。为了提高检测的灵敏度和分辨率，糖类经常有紫外或荧光标记的衍生化后，用硅胶做固定相，以正己烷一二氧六环为流动相，在紫外或荧光检测器上检测单糖或寡糖;另一种方法是以离子交换树脂或凝胶做固定相，水或盐溶液为流动相，用示差检测器或采用柱后衍生化方法，用可见光、紫外光或荧光检测器检测，以提高检测灵敏度。此外，HPLC还可以测定多糖的分子量，可以对糖进行定量分析。
2.3电泳法
电泳技术在近年得到了飞速的发展，可用于糖及糖复合物分析的电泳方法有:柱电泳、薄层电泳和毛细管电泳(CE)三类。其中CE是80年代发展起来的一类新型的高效、快速、微量的仪器化电泳技术，常用自由溶液介质，只能分离离子组分和中性组分。柱电泳和薄层电泳亦称经典电泳，多用凝胶或纤维素介质，只能分离离子组分。若用聚丙烯酞胺凝胶为介质，因其空间网络具有“分子筛”效应，可按离子的大小分离。

2.4其它方法
糖在自然界中是广泛存在的一种物质，在研究上也适用于很多方法，如用于纯度测定的比旋度法、超离心法、高压电泳法、凝胶过滤法等;用于分子量测定的渗透压法、蒸汽法、端基法、光散射法、粘度法等;用于结构研究的化学方法:高碘酸氧化法、史密斯降解法、甲基化反应等;用于糖链结构分析的光谱法以及质谱、核磁共振在糖类化合物上的应用。

总的来说，多糖的研究方法已经比较成熟，但对于不同的原料、不同类型的多糖以及不同的分析要求，所选择的分析方法也不尽相同。但由于样品在气相中传递速度很快，加上可以选用广泛的固定液和采用灵敏的检测器，因而气相色谱具有选择性强、分辨力好、灵敏度高以及分析速度快等优点。因此，在进行糖类的研究中应用最为广泛。

3多糖的生物活性
3.1抗肿瘤活性
多糖的抗肿瘤活性一般是通过增强免疫细胞的活性来实现的;其次，通过影响细胞生化代谢，可以干扰或抑制磷脂酞肌醇转换为一定的抗癌作用;多糖可以促进肿瘤细胞脂质过氧化，加速肿瘤细胞的死亡。它的抗肿瘤作用与单糖糖昔键的结合方式有关;还与其立体结构有关，若螺旋立体结构被破坏，则多糖的活性大大降低;此外，多糖的抗肿瘤活性的大小还与多糖的分子量、取代基、溶解度、粘度、给药剂量和途径以及提取方法等因素有关。

3.2多糖的抗病毒活性
研究表明，许多多糖对病毒有抑制作用，如艾滋病毒、单纯疤疹病毒、巨细胞病毒、流感病毒、囊状胃炎病毒、劳斯肉瘤病毒和鸟肉瘤病毒。多糖的抗病毒作用现已引起医药界的高度重视，尤其是硫酸多糖的强抗病毒活性，显示了多糖广阔的药用前景。